🚀David Baker preprint van @UWproteindesign 👇👇 Wat maakt het zo uitdagend om eiwitbindingen te knippen, dat de natuur gespecialiseerde enzymen met metaalcofactoren heeft ontwikkeld om dit te bereiken?@biorxivpreprint @ETH_en "Computational design van cysteïne proteasen" • Amidebindingen in eiwitten hebben een halveringstijd van honderden jaren onder fysiologische omstandigheden, waardoor ze veel stabieler zijn dan esterbindingen (met amine verlatingsgroepen met pKa >35 versus <8 voor geactiveerde esters), en eerdere computationele enzymontwerpen zijn alleen geslaagd met geactiveerde kleine molecuulester-substraten in plaats van de energetisch veeleisende peptidebindingknip die vereist is voor proteasen. • De onderzoekers gebruikten RoseTTAFold Diffusion 2 voor Moleculaire Interfaces (RFD2-MI) om zinkproteasen te ontwerpen vanuit minimale katalytische motieven, waarbij een ideaal actieve site werd geconstrueerd met vijf functionele groepen (drie zinkbindende residuen H1, H2, E1, één katalytische base E2, en één oxyanion-stabiliserende tyrosine Y) gebaseerd op aminopeptidase N en astacinestructuren, en voerden een tweezijdig ontwerp uit van zowel protease- als substraatsequenties om een nauwkeurige positionering van de doelamidebinding te waarborgen. • Van de 135 ontwerpen die in één ontwerpronde werden getest, toonde 36% activiteit (14,7% voor alleen Zn-modellen en 87,5% voor Zn-water modellen), waarbij alle actieve ontwerpen precies op de bedoelde locaties knipten, bevestigd door massaspectrometrie; het meest actieve ontwerp (Zn45 dat ZnO36-substraat knipt) bereikte een kcat van 0,025 ± 0,002 s⁻¹, KM van 26 ± 5 μM, en kcat/KM van 900 ± 200 M⁻¹s⁻¹, wat >10⁸-voudige versnelling van de snelheid vertegenwoordigt ten opzichte van ongekatalyseerde hydrolyse; ontwerpen vertoonden zinkbinding met Kd tussen 10⁻¹⁰ en 10⁻⁸ M, toonden substraatspecificiteit in 4 van de 5 schimmels, en konden opnieuw worden geprogrammeerd om de ziekte-relevante menselijke TDP-43-eiwit te knippen met 4 varianten die ≥80% knipten na 5 uur. Auteurs: Hojae Choi et. al Donald Hilvert, Samuel J. Pellock, David Baker Link: